Resultados

La eficacia de la detección de Salmonella spp. y L. monocytogenes por RTi-PCR en muestras de fuet tratados o no tratados por alto la presión hidrostática se ensayó frente a la PCR convencional y los métodos microbiológicos convencionales. Se realizó además una detección múltiple en combinación con distintos pretratamientos. El límite de detección en función del pretratamiento fue de entre 10² cfu/ml y 10⁵ cfu/ml.

Con este trabajo se pretende comprobar la presencia de dos patógenos de especial relevancia en salud pública, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes en longanizas oreadas. Igualmente se analiza la presencia y concentración de Listeria spp. como indicador-suministrador de la evidencia de que el sustrato reúne las condiciones idóneas de crecimiento y desarrollo de Listeria monocytogenes.

El objetivo de este estudio es realizar un control microbiológico ambiental en distintos puntos del proceso de producción de alimentos cárnicos en industrias de Aragón, províncias de Zaragoza y Teruel.

La presencia de microorganismos en los productos cárnicos listos para el consumo es una de las principales preocupaciones de la industria cárnica. La aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de APPCC es una premisa para minimizar el riesgo de los consumidores de estos productos. Los estudios de seguridad alimentaria son necesarios para asegurar el producto hasta el final de su vida útil. Los métodos de microbiología clásica son laboriosos y requieren varios días hasta la obtención de resultados definitivos. Entre los métodos rápidos alternativos, destaca la PCR como una de las técnicas diagnósticas más populares en microbiología de los alimentos.

El objetivo de este trabajo esel de realizar un control de la seguiridad alimentaria en la indústria cárnica de la provincia de Zaragoza mediante la detección y cuantificación de L.monocytogenes en productos cárnicos el día de la compra, a mitad y al final de su vida útil almacenados entre 4ºC y 10ºC.

El objetivo de este trabajo es establecer la incidencia de cepas patógenas de Aeromonas móvilas, Salmonella y Yersinica enterocolitica así como de genes de patogenicidad de estos grupos bacterianos en productos cárnicos (mayoritariamente listos para el consumo) comercializados en la ciudad de León.

El objetivo de este trabajo es estudiar la incidencia, la prevalencia y la edtección de E.coli O157:H7 en productos cárnicos RTE mediante PCR convencional y PCCR en tiempo real.

Se han presentado las técnicas de PCR convencional y a tiempo real como técnicas rápidas, sensibles, específicas y eficientes  para su aplicación en la detección de patógenos alimentarios de origen bacteriano. Se ha enfatizado la mejora tecnológica y diagnóstica que ha supuesto la implantación de la PCR a tiempo real versus la convencional y se ha establecido la necesidad del uso de controles internos por la posible presencia de inhibidores en los alimentos. Se han presentado ejemplos de aplicación mediante el estudio de la incidencia de los patógenos alimentarios, Listeria monocytogenes y Salmonella en industrias artesanales de embutidos tradicionales y en muestras de fuets inoculados (103 ufc/g) de forma artificial y tratados con antimicrobianos naturales y alta presión hidrostática. Se ha planteado la problemática de la técnica cuando se utiliza para la cuantificación de los criterios de rendimiento en las técnicas de descontaminación que requieren la inoculación de niveles elevados de bacterias patógenas, debido a la presencia e interferencia de las células muertas. Se han presentado las diferentes estrategias que se están evaluando para la detección diferencial de células viables, RT-PCR, tinción con fluoróforos y gradientes de densidad diferencial.

Se pretende desarrollor la metodología para conseguir una alta sensibilidad en la detección de organismos patógenos en muestras cárnicas reales mediante un método preciso, reproducible y rápido.

A partir de los resultados obtenidos se dispones de un método de extracción de ARN y de PCR Tiempo Real para detectar tanto HAV como NoV, con diversas alternativas (cebadores/sondas) que presentan una adecuada sensibilidad habiendo obtenido curvas de calibración con un buen coeficiente de correlación, linealidad y eficacia de detección. El límite de amplificación de esta reacción de PCR se ha establecido en 5 copias de genoma/muestra. Esta técnica puede ser implantada en laboratorios de análisis de alimentos para el control higiénico-sanitario y actuación en caso de riesgo epidemiológico.En la actualidad se están desarrollando protocoles específicos para e análisis de productos cárnicos donde pueda existir riesgo asociado a dichos patógenos bien porqué se trate de alimentos listos para el consumo (RTE) que han sufrido manipulación o bien porqué el proceso de elaboración no incluya tecnologías que garanticen su eliminación, para lo cual se seleccionaran matrices de forma coordinada con el proyecto desarrollado por A.Bosch (Procarte. Acción 3). De forma complementaria, se está evaluando la incorporación de controles (ejm virus mengo, controles endógenos, controles de RT...) que permitan la cuantificación y garanticen la validez de los resultados en su uso como herramienta de control en salud pública.

Objetivos:- Establecer la incidencia de cepas patógenas de Aeromonas en carnes frescas y en productos cárnicos listos para el consumo (fase de comercialización).- Establecer la similitud de las cepas aisladas de estos alimentos y las procedentes de casos clínicos (aisladas de la misma zona geográfica: León).

La PCR a tiempo real es uno de los métodos alternativos de detección de patógenos en alimentos más populares. Esta técnica presenta una gran sensibilidad (detecta hasta una molécula por reacción), rapidez y sencillez. Además, el formato en tubo cerrado puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. Uno de los inconvenientes de su aplicación en alimentos se debe a la complejidad de la matriz alimentaria (que requiere un pre-tratamiento)  y a la baja concentración en la que suelen estar los microorganismos patógenos en los alimentos, frecuentemente inferior a 100 UFC/g (lo que requiere un enriquecimiento previo de la muestra)El objetivo del estudio es la evaluación de diferentes tratamientos pre-PCR para embutidos y estimación del límite de detección de la PCR a tiempo real según el tipo de pre-tratamiento y muestra.

Se han diseñado primers y optimizado las condiciones para obtener un método de RTi‐PCR múltiple que permitiera la detección sensible y específica de E. coli O157:H7 con tecnología SYBR® Green I. Los productos amplificados con las dos parejas de primers presentaban una curva de disociacióncon 2 picos que permitían la diferenciación de los 2 productos obtenidos con la RTi‐PCR múltiple. No se detectaron productos amplificados en otras cepas probadas en el ensayo de especificidad. El método mostró una gran sensibilidad y su aplicación en los productos cárnicos inoculados artificialmente está siendo óptima.

A partir de los resultados obtenidos se ha conseguido obtener un método analítico válido para el análisis de los virus de la hepatitis A y NoV aplicado a productos cárnicos utilizando la técnica de la RT-PCR a tiempo real. Los datos iniciales obtenidos en la validación indican una buena eficiencia de extracción y amplificación, así como un LOD y LOQ  aceptables.

Se ha desarrollado un método de PCR para la detección rápida de E.coli O157:H7 en productos cárnicos. Se evaluaron distintos procesos de enriquecimiento selectivos y no selectivos, tiempos de enriquecimiento (0, 2, 4, y 6 horas), métodos de extracción con y sin separación inmunomagnética (Dynabeads anti-E.coli O157:H7) y distintos protocolos de PCR. El protocolo de pretratamiento y condiciones de PCR seleccionado permitió la detección de niveles muy bajos de E.coli O157:H7 sin necesidad de enriquecimiento (< 10 ufc/g). Este método optimizado se ha analizado con muestras de salchichón y bacon inoculadas artificialmente para evaluar el efecto de la matriz en la preparación de las muestras para la PCR. El límite de detección para el salchichón y el bacon es menor de 10 ufc/g después de un enriquecimiento de 2 y 4 horas respectivamente.

Se evaluaron veintiún métodos de muestreo para la recuperación de L.monocyotgenes de distintas superfícies para determinar la major técnica de muestreo en la industria cárnica. Los mejores resultados se obtuvieron con un miniroll de nylon. Éste y otros 4 métodos se utilizaron para evaluar la incidencia de L.monocytogenes en las industrias cárnicas.

Se ha analizado la incidencia de Aeromonas en carne fresca de conejo, cordero y cabra. No se detectáron Aeromonas en ninguna de las muestras de cordero ni de cabra pero sí en el 45% de las muestras de conejo. las principales cepas encontradas fueron: A. hydrohpila, A. caviae y A. sobria. La mayoría de las cepas detectadas presentaban actividad haemolítica (60%) mientras que el 50% presentaba actividad elactolítica.

Además se analizó la presencia de Aeromonas en las heces de los pacientes alimenticios del hospital de León. Se identificaron las siguientes cepas: A. hydrophila, A. caviae y A. veronii.

Se encontraron algunas correlaciones entre los perfiles de electroforesis de campo pulsátil de las cepas aisladas de la carne de conejo con el de los pacientes hospitalizados per problemas alimenticios.

Se han desarrollado distintos métodos de extracción de RNA para la detección del virus de la Hepatitis A y norovirus por RT-PCR. Estos métodos con partículas de silicio son efectivos para la extracción de RNA.